Eugene Levy empezó su carrera profesional en la compañía de teatro Second City. Al cabo de dos años fue parte del equipo que creó, escribió y protagonizó "Second City TV", que empezó a emitirse a mediados de los años setenta hasta el año 1983. Ganó dos Emmy como parte del equipo de guionistas de la serie.

En 1989 dirigió el especial "I, Martin Short, Goes to Hollywood". A continuación dirigió su primer largo, Sólo falta el asesino, con John Candy y Jim Belushi, al que siguieron los telefilms "Sodbusters", del que también fue coguionista y productor ejecutivo, y "Partners’n Love", en el que trabajó como actor.

En 1996 escribió con el director Christopher Guest el guión de Esperando a Guffman, en la que también trabajó. Volvieron a colaborar en 2000 para Very important perros, por la que fueron nominados al Premio del Sindicato de Guionista de América y al Globo de Oro al Mejor Guión. Le siguieron Un poderoso viento, por la que fueron nominados a un Premio Espíritu Independiente al Mejor Guión, y Eugene Levy al Mejor Actor Secundario por el Círculo de la Crítica de Cine Neoyorquina, y For Your Consideration, en 2006.

Trabajó en la taquillera American Pie, de Paul y Chris Weitz, así como en las secuelas. Otras películas suyas son 1, 2, 3,… Splash, de Ron Howard; Locas vacaciones de una familia americana, Club Paraíso y Mis dobles, mi mujer y yo, las tres de Harold Ramis; El padre de la novia, Me gustan los líos y Vuelve el padre de la novia, las tres de Charles Shyer y Nancy Meyer; Se montó la gorda y Doce fuera de casa, las dos de Adam Shankman, y más recientemente, Noche en el museo 2, de Shawn Levy.

Ha prestado su voz a las películas de animación Heavy Metal, de Gerald Potterton; Jorge el curioso, de Matthew O’Callaghan; Vecinos invasores, de Tim Johnson y Karey Kirkpatrick, y al próximo estreno Astro Boy, de David Bower.