Jane Lynch empezó trabajando con las compañías teatrales The Second City y Steppenwolf Theatre Company, y en muchas funciones en la zona de Chicago.

Recientemente ha actuado en películas como Julie & Julia, The Post-Grad Survival Guide, Spring Breakdown, Another Cinderella Story, Brownie Masters, The Rocker y en la película de animación Space Chimps: misión espacial. Otras películas suyas son For Your Consideration, de Christopher Guest; A Mighty Wind/Un poderoso viento; Very important perros; Alvin y las ardillas; Dewey Cox: una vida larga y dura; Pasado de vueltas; Virgen a los 40; Bam Bam and Celeste, de Margaret Cho; Suffering Man’s Charity, de Alan Cumming; Una serie de catastróficas desdichas de Lemony Snicket, y Surviving Eden.

En televisión la hemos visto no hace mucho en las series "Agencia Lovespring", "Mujeres desesperadas" y "Weeds". Actualmente trabaja en "The L World", con Cybill Shepherd. Tiene papeles habituales en "Boston Legal", "Dos hombres y medio", "Mentes criminales" y "Las aventuras de Christine".

Su obra teatral "Oh Sister, My Sister!" ha sido estrenada en el Tamarind Theatre y en el Bang Theater, y ha sido galardonada con el Premio de Teatro a la Comedia del semanario LA Weekly.