Hizo su debut en Broadway como "Aston" en el drama de Harold Pinter The Caretaker, dirigida por David Jones. El último año, MacLachlan actuó en los teatros de Londres junto a Woody Harrelson en "On An Average Day" del director John Crowley en el Comedy Theatre en West End, en Londres.

MacLachlan es más conocido por su actuación como el agente del FBI Dale Cooper en la serie de éxito "Twin Peaks" de David Lynch, por la que recibió un Globo de Oro y dos nominaciones al Emmy. MacLachlan hizo su debut en el cine en el drama futurista de Lynch, Dune, seguida por su papel clave como Jeffrey Beaumont en Blue Velvet de Lynch.

MacLachlan también interpretó el papel del hombre ideal de Charlotte, el cardiocirujano Dr. Trey MacDougal en la aclamada serie de HBO "Sex and the City".

Ha aparecido en las películas independientes Miranda, con Christina Ricci y John Hurt; Perfume con Peter Gallagher y Paul Sorvino; y Me, Without You. En 2000, MacLachlan también protagonizó junto a Ethan Hawke, Hamlet, de Miramax, que tuvo un gran recibimiento por parte de la crítica cuando se estrenó en el Sundance Film Festival. Dirigida por Michael Almereyda, esta versión cinematográfica traspasó el entorno del Bardo en Manhattan con MacLachlan interpretando a un Claudius moderno.
También participó en la película experimental de Mike Figgis Timecode, la primera película que se rueda simultáneamente con cuatro cámaras digitales, en una toma continua de 93 minutos. MacLachlan trabajó previamente con Figgis en la película One Night Stand.

Otros trabajos de MacLachlan incluyen The Trigger Effect, Los Picapiedra producida por Steven Spielberg; la controvertida Showgirls de Paul Verhoeven. También apareció como el legendario teclista Ray Manzarek en The Doors, dirigida por Oliver Stone; The Hidden; interpretó a Josef K en The Trial, adaptada por Harold Pinter, y co-protagonizada por Anthony Hopkins; y participó en Rich in Love de Bruce Beresford, co-protagonizada por Albert Finney y Jill Clayburgh.

También protagonizó junto a Samuel L. Jackson en el telefilm de HBO ganador de varios premios, "Against the Wall", la historia de los disturbios de la prisión de Attica de 1971, dirigida por John Frankenheimer; y en la película original de Showtime, Roswell. MacLachlan hizo su debut como director en 1993 con un episodio de la serie de comedia negra de éxito de HBO, Tales From the Crypt.

Actualmente reside en Nueva York con su mujer y con sus perros Mookie y Sam.